De stad ontstond als dijkdorp aan de voet van een kunstmatige heuvel aan de samenvloeiing van de Oude en de Nieuwe Rijn. In de oudste vermelding daarvan, omstreeks 860, werd het toenmalige dorp Leithon genoemd. In de op deze heuvel gelegen burcht zetelde aanvankelijk een leenman van de bisschop van Utrecht, maar de burcht kwam omstreeks 1100 in handen van de graaf van Holland. De gunstig gelegen nederzetting kreeg in 1266 bevestiging van de reeds eerder verleende stadsrechten en ontwikkelde zich met haar bloeiende lakennijverheid tot een van de grootste steden van het gewest Holland. In 1389, toen de bevolking tot ongeveer 4.000 was gegroeid, moest de stad worden uitgebreid met het stadsdeel tussen Rapenburg (tevoren de zuidrand van de stad) en de Witte Singel.
In 1420 werd Leiden, in het kader van de Hoekse en Kabeljauwse twisten veroverd door hertog Jan VI van Beieren. Op 1 maart 1512 stortte de ruim 100 meter hoge toren van de Pieterskerk bij een storm in. De toren, één van de hoogste van Nederland, werd nimmer herbouwd.
Leidens ontzet
In 1572 koos de stad de zijde van de anti-Spaanse opstand. De Spaanse landvoogd Requesens belegerde in 1574 de stad. Nadat dit beleg was afgeslagen – Leidens ontzet van 3 oktober 1574 – kreeg de stad in 1575 met de Universiteit Leiden de eerste universiteit van Nederland. De in vele bronnen gegeven verklaring dat stadhouder Willem van Oranje hiermee zijn erkentelijkheid aan de Leidenaren betuigde is enigszins twijfelachtig. Willem had namelijk een een politiek/bestuurlijke reden voor de oprichting van een universiteit: de behoefte aan goed opgeleide getrouwen. De universiteit voert als motto Praesidium Libertatis, wat ‘bolwerk van de vrijheid’ betekent.
In de 17e eeuw kwam de stad tot grote bloei, dankzij de impuls die vluchtelingen uit Vlaanderen gaven aan de textielnijverheid. De stad, die voor het beleg van 1574 ongeveer 15.000 inwoners had geteld, waarvan tijdens het beleg ongeveer een derde deel het leven had verloren, was in 1622 tot 45.000 inwoners gegroeid en omstreeks 1670 werd zelfs een aantal van tegen de 70.000 bereikt. In de Gouden Eeuw was Leiden, na Amsterdam, de op één na grootste stad van Nederland. De bevolkingsgroei maakte een aanleg van nieuwe grachten en singels noodzakelijk. Het huidige centrum van Leiden, herkenbaar aan het singelpatroon, werd in 1659 voltooid.
In de 18e eeuw raakte de textielnijverheid in verval, door protectionistische maatregelen in Frankrijk en de lonen, die vanwege de kosten van levensonderhoud in het gewest Holland relatief hoog moesten zijn. Het gevolg was een gestadige daling van het inwonertal van Leiden, dat eind 18e eeuw tot 30.000 was gedaald en omstreeks 1815 een dieptepunt van 27.000 zou bereiken.
Het Rapenburg na de Leidse buskruitramp
Op 12 januari 1807 vond de Leidse buskruitramp plaats, waarbij ongeveer 150 burgers om het leven kwamen. Koning Lodewijk Napoleon bezocht persoonlijk de stad om de hulp aan de slachtoffers te coördineren. Op de plaats van de door de ontploffing veroorzaakte “ruïne” werden later hetVan der Werfpark en het Kamerlingh Onnes Laboratorium aangelegd. In 1842 werd de voor Leiden zeer belangrijke spoorlijn naar Haarlem in gebruik genomen. In 1866 werd de stad getroffen door de laatste grote epidemie (cholera) welke in 1868 leidde tot de start van de bouw van het nieuw Academisch Ziekenhuis. In 1883 werd niet alleen Leiden, maar ook de rest van Nederland, opgeschrikt door het nieuws van de arrestatie van de Maria Swanenburg, bijgenaamd Goeie Mie, een gifmengster die in enkele jaren tijd minstens 27 slachtoffers had gemaakt. Mede dankzij de spoorlijn was in de 19e eeuw enige verbetering opgetreden in de desolate sociaal-economische situatie, maar het aantal inwoners was omstreeks 1900 nog steeds niet ver boven de 50.000 opgeklommen. Pas in 1896 begon Leiden zich uit te breiden buiten de 17e-eeuwse singels.